子計畫二：農業廢棄物再資源化
主持人：黃介辰
團隊成員：李思禹、蔣恩沛、黃皓瑄、張嘉修(成大)
一、子計畫推動重點、成果與特色亮點
1.本計畫擬藉由從耐鹽植物中獲得的內共生菌，探討此菌株是否可提升阿拉伯芥及其他作物抗鹽份和其他非生物性逆境的機制，解析其共生機轉後並嘗試接種於不同十字花科等蔬菜作物，擴大此菌的應用範圍，並進一步將其抗逆境代謝產物以自營性細胞工廠方式進行生產成新型的植物調節劑，期在面對氣候變遷與糧食需求增加的狀態下，不必再仰賴基因轉殖作物的開發，並開創一項更具效益且能有效提升植物對抗非生物性逆境的研究新策略，以降低各式環境逆境對經濟作物生長之危害。
2.完成構築一株可生產植物生長刺激素PQQ(Pyrroloquinoline quinone)之大腸桿菌株（以下稱JM109-PQQ）, 並有效提高JM109-PQQ的生長效率。由本團隊所構築之木質纖維素水解酵素水解之狼尾草粉末, 經48小時水解後產生的糖化液可用於培養JM109-PQQ, 並具有生產PQQ之潛力。
圖1 PQQ相關基因之質體設計
圖2 成功轉植PQQ相關基因至大腸桿菌株。（圖左為基因大小標的, 圖中為轉植後的大腸桿菌株進行質體純化的結果, 圖右為含有PQQ質體的標準品）
圖3 含有PQQ之大腸桿菌株在相同條件培養下可達到較高的濁度。（圖左為對照組之大腸桿菌株, 圖右為含有PQQ相關基因之大腸桿菌株）
3. 建立適用於微生物之PQQ、單碳代謝、維生素 B6、短鏈脂肪酸、有機酸、中長鏈脂肪酸、胺基酸、DNA、機能性物質等代謝產物之追蹤偵測平台。運用穩定碳 13 同位素標定追蹤菌體內代謝流向與動態平衡，藉由不同營養源探討菌體不同營養源之代謝特性，作為學術層面之背景知識探討，提供合作單位開發合成生物技術之建構策略依據。
二、學術研究面向推動重點、成果與特色亮點
(1) 探討建構之植物促生長素轉殖菌 E. coli JM109 DE3 ( ) 之醣類代謝特性將建構出具生產植物促生長素能力轉殖菌株 E. coli JM109 DE3 ( )，配合建立的微生物代謝流向追蹤平台，分析其糖類代謝的路徑與特性，比較 E. coli JM109 DE3 ( ) 與轉殖空質體之對照組 E. coli JM109 DE3 empty vector 之差異。先將兩株菌以 37oC、12~16 hr 個別活化於添加篩選抗性基因之抗生素卡納黴素 (Kanamycin、30 μg/mL) 之 LB broth。1% 轉接量轉接至培養基 (0.5% glucose、0.2% citrate sodium tribasic、1% potassium phosphate dibasic、0.35% ammonium dihydrogen phosphate、30 μg/mL kanamycin)，以 37oC、200 rpm 進行第一階段培養 25 hr，之後添加 0.5 mM IPTG 誘導 E. coli JM109 DE3 ( ) 轉殖調控基因啟動大量生產植物促生長素，之後維持相同培養條件進入第二階段培養 38 hr 後，區分胞內外檢體進行取樣。為追蹤菌體攝取特定營養源後的代謝流向， 使用穩定同位素碳 13 標定之營養素作為追蹤劑 (tracer)，經氣相層析質譜搭配電子撞擊離子模式 (EI mode)，設定單一離子監測模式 (SIM mode)，來追蹤代謝物的碳 13 標定量 (enrichment)，分析營養源的代謝路徑流向。本研究使用碳 13 標定一號碳位的葡萄糖 (1-13C glucose)，以 50% 取代量作為追蹤劑。培養過程中分別選擇第一階段培養 12 hr、第二階段培養 6 hr 與 12 hr 等不同階段的時間點進行取樣，以探討菌體對於葡萄糖的代謝動力學。初步分析結果如圖4所示。整體來看，對照組 (n=6) 在丙酮酸 (pyruvate 1) 與乳酸 (lactate 1) 的標定量分別為 0.366±0.071、0.092±0.063，轉殖株 (n=5) 則分別為 0.293±0.098、0.044±0.010，學生 t 檢驗 (student's t-test) 發現轉殖株於兩化合物之標定量皆趨勢下降 (p=0.173、0.124)。在檸檬酸循環中下游的化合物琥珀酸 (succinate) 與延胡索酸 (fumarate) 中，兩組菌株之間沒有顯著差異。對照組的 succinate 1 與 fumarate 1 標定量分別為 0.122±0.065、0.332±0.143，轉殖株則為 0.077±0.045、0.283±0.169。 時間點差異部分可發現，對照組隨培養時間增加，乳酸會有逐漸累積的現象。由第一階段培養 12 hr 到第二階段培養間，lactate 1 標定量分別為 0.037±0.024、0.080±0.054、0.160±0.024 (n=2)，第二階段培養比第一階段培養的乳酸標定 量有趨勢上升的現象 (p=0.132)，但在轉殖株並未發現此累積現象。另外比較目前 測定的四種代謝產物標定量可發現乳酸標定量明顯低於其它三者，標定量平均僅為 0.04 左右，研判因菌株培養條件屬於有氧培養，因此菌株缺少厭氧發酵路徑使乳酸生成量減少。目前本研究持續探討不同碳源的代謝流向，以探討菌體合成植物促生長素之機制。
圖4 分析結果
(2) 從耐鹽植物中獲得的內共生菌，探討此菌株是否可提升阿拉伯芥及其他作物抗鹽份和其他非生物性逆境的機制，解析其共生機轉後並嘗試接種於不同十字花科等蔬菜作物，擴大此菌的應用範圍，並進一步將其抗逆境代謝產物以自營性細胞工廠方式進行生產成新型的植物調節劑，不必再仰賴基因轉殖作物的開發，並開創一項更具效益且能有效提升植物對抗非生物性逆境的研究新策略，以降低各式環境逆境對經濟作物生長之危害。
圖5 培養基添加PQQ根部生長圖。經PQQ處理後根部發育明顯增長。由左至右為處理0 nM、5 nM、50 nM、100 nM及1000 nM PQQ之北蕉苗
三、產學合作面向推動重點、成果與特色亮點
生科系黃介辰教授團隊以「全方位植物內生菌抗逆境生長調節劑」此項關鍵技術。建立跨國之研究團隊與日本東北大学環境科学研究科進行「進化型分子生物工学手法の導入による新規金属資源回収技術の実現」計畫。與國立中興大學國際產學聯盟、美和科技大學生物科技系、帝霖股份有限公司，進行研發成果萌芽計畫-開發微生物二次代謝物質防治香蕉黃葉病之生物製劑商品化計畫。與台灣糖業股份有限公司進行台糖公司108年度「PM菌株降解環境毒化物動力學探討」委託研究計畫。
