子計畫二：農業廢棄物再資源化
主持人：黃介辰
團隊成員：李思禹、蔣恩沛、黃皓瑄、張嘉修(成大)
一、子計畫推動重點、成果與特色亮點
本計畫利用纖維素水解酵素水解農業廢棄物如稻稈等富含纖維素之固體廢棄物產生之糖化液，加入特定比例豆渣汁及微量元素，調配出適合枯草桿菌Bacillus subtilis之培養基。研究成果顯示，該培養液發酵後可產生生物刺激素PQQ，經適當比例稀釋用於植物澆灌，有利於增加植物株高、開花結果期提早等生長助益。經評估，本計畫所生產之PQQ發酵液具有低成本且無需改變慣行農法之特點。為提高產品效果與檢測有效成分濃度，本計劃利用HPLC及LC-TOF等液相層析法作為檢測方法，並透過濃縮及萃取，提高PQQ濃度，以利於後續產品開發需求。
建立微生物檢測 Pyrroloquinoline quinone (PQQ) 技術與平台
本計畫持續建立微生物檢測 PQQ 技術與平台，我們成功使用LCMS檢測到PQQ標準品的precursor 和m/z product ions分別為241與285。PQQ 標準品full scan 結果如圖一所示。本計畫成功檢測PQQ LOD及LOQ，standard curve如圖二所示。顯示本分析技術已趨純熟，可實質運用於生物檢體之分析。
本計畫持續建立微生物檢測 PQQ 技術與平台，我們成功使用LCMS檢測到PQQ標準品的precursor 和m/z product ions分別為241與285。PQQ 標準品full scan 結果如圖一所示。本計畫成功檢測PQQ LOD及LOQ，standard curve如圖二所示。顯示本分析技術已趨純熟，可實質運用於生物檢體之分析。
圖一為PQQ 標準品full scan 圖譜
圖二為PQQ standard curve
圖二為PQQ standard curve
本計畫將進一步建立PQQ生物樣品的檢測方法，我們使用 Waters Sep-Pak Vac 1 cc C18 管住進行純化，並比較不同溶劑流提下來的流提液，進行LCMS分析。本檢測技術優化後的流程簡述於下：取 50 mL菌液樣品添加 4 mL 1 M HCl、50 μL 2-mercaptoethanol、100 μL 10% (w/v) potassium ferricyanide、10 mL n-butanol。均質 5 min 後以冰降溫，800 g 離心 5 min。取出有機層至裝有 20 mL n-hexane、1 mL pyridine、0.1 g NaCl、1 mL 去離子水的容器中，震盪 5 min 混勻。再以 800 g 離心 5 min，取出水層進行真空乾燥。乾燥後粉末以 10 mL 0.1 M HCl 復溶，經 Sep-Pak C18 管柱進行純化，接著使用 0.3 mL 5% (v/v) pyridine in water 作為流洗液所收集的檢體分析後，純化後檢體再進行真空乾燥，乾燥後的檢體再以去離子水回溶。圖三為在相同PQQ含量在没有使用Waters Sep-Pak column (左)及有使用Waters Sep-Pak column (右) 之比較，在這次實驗中發現使用Waters Sep-Pak column會損失4~5倍的量。實驗結果顯示本分析技術及檢體萃取方法已趨純熟，可進一步實際運用於生物檢體之分析。
圖三為在相同PQQ含量没有使用Waters Sep-Pak column (左)及有使用Waters Sep-Pak column (右) 比較。
(一)人才培育面向
參與學生人數14人，107年共培育碩士，博士共計11人，延攬研究助理3名，生科系黃介辰、黃皓瑄教授及食生系蔣恩沛教授共同指導「全方位植物內生菌型生物刺激素」團隊，參加科技部主辦「第十七屆國家新創獎」競賽，在上百隊提案隊伍中脫穎而出，榮獲學研新創獎殊榮，並於110年度於第十八屆國家新創獎精進續獎。
- 2021 蔣恩沛教授指導研討生 吳明璁 榮任英國台灣商會秘書長 Louie Wu elected as the Secretary-General of the British Taiwan Chamber of Commerce
- 2021 蔣恩沛教授指導研討生 彭建豪 BEST Conference & International Symposium on Biotechnology and Bioengineering 國際生物技術與生化工程學會研討會 Poster Award 海報優等獎
- 2021 蔣恩沛教授指導研討生 游淯甯 蘇雅麗 彭建豪 國家新創獎-精進續獎 National Innovation Award
- 2021 蔣恩沛教授指導研討生 鍾睿遠 US Dietician 取得美國營養師執照
- 2021 蔣恩沛教授指導大學生 劉詠淳 獲科技部大專生計畫
- 2021 蔣恩沛教授指導研討生 蘇雅麗參加 2021 UCSD-NCHU/ENABLE/IDCSA Joint Symposium Poster: Glycine N-methyltransferase expression alters methotrexate drug responses in mitochondrial 1C metabolism and TCA cycle in vivo
- 2021 蔣恩沛教授指導研討生 彭建豪參加 2021 UCSD-NCHU/ENABLE/IDCSA Joint Symposium Poster: Metabolic fate of carbon during CO2 carboxylation in a constructed carbon fixing microbe
- 2021 黃介辰教授指導中興大學iGEM以「給未來農業之人造植物內生菌」（Artificial endophyte for future agriculture）為研究主題參加由美國麻省理工學院發起之國際遺傳工程機器設計競賽（International Genetically Engineered Machine Competition）中榮獲金牌獎。團隊成員來自6個學院11個學系，包括環境工程學系沈易萱（隊長）；土壤環境科學系劉佳和（隊長）、鍾郁欣、江柏霆；園藝學系盧繹迦；植物病理學系陳以樂、張巾龔；生命科學系楊佐元、張永弘；化學系翁子婷；化學工程系龔睿騰；資訊工程學系江尚軒；農藝學系王崇安；動物科學系林宗嶧、張軒綸；中文系吳侑芸。團隊並由資深iGEM隊員生科系碩士生洪世勳與黃優人負責設計試驗與實驗教學、進度報告與博士生方翟協助監督。https://news.ltn.com.tw/news/life/breakingnews/3763953
(二)學術研究面向
先前研究成果中，已獲得幾株可促進植物抵抗逆境之菌株，包含抗香蕉黃葉病的Burkholderia sp. 869T2、抗高鹽逆境的Bacillus sp. BP01-R2與Pseudomonas sp. BP02-R8，其分別篩選自培地茅與雲林莞草。國外研究指出，Burkholderia可分泌生物刺激素PQQ，透過定序確認，Burkholderia sp. 869T2為可分泌PQQ之菌株。基於先前研究成果，將纖維素水解酵素用於水解農業廢棄物，分解後產生大量醣類，並結合豆渣，提高氮源以增加培養基適用度，用於PQQ分泌菌株之培養。經澆灌於水稻後，除株高提高外，結穗數量也較對照組多。
左圖為無PQQ基因之發酵液，右圖為有PQQ基因之發酵液。
(三)產學合作面向
- 蔣恩沛教授擔任財團法人農業科技研究院董事
- 蔣恩沛教授於2021年07月18日與全瑩生技技術交流，與執行長張瑞仁博士討論本團隊運用合成生物學的技術建立生產 S-腺苷基甲硫氨酸微生物之構想與本團隊運用不同質譜平台所建立的 S-腺苷基甲硫氨酸定性定量分析與代謝路徑追蹤之獨特技術。同時推廣介紹本團隊的研究成果，討論未來可能產學合作的規劃。
(四)研究貢獻面向
- 蔣恩沛教授研究團隊開發「新穎益生菌配方之新用途及基於此新用途之製劑」。該研究發現含特定益生菌組成比例之新配方可做為健康人提升維生素地增進劑，亦可應用於缺血性患者體內活化維生素之B6促進劑，預防由於體內活化維生素B6缺乏所引起的疾病、提升健康，已提出專利申請。
二、未來展望
本計畫將進一步篩選出天然具有合成 PQQ 能力的菌株 Burkholderia cenocepacia 869T2 進行檢測。今年本計畫子計畫蔣教授實驗室已經成功建立PQQ檢測方法，接下來將優化質譜分析方法及檢體萃取方法，克服微生物基質干擾及生物體目標代謝物濃度較低等問題，找到合適內標。微生物中PQQ為含量低且不穩定代謝物，將進一步提高LCMS偵測PQQ感度及優化萃取微生物中PQQ方法。計算微生物中的回收率 (Recovery) 並定量各菌株PQQ含量。
照片圖說：生命科學系黃介辰特聘教授(前排左1)率隊參加2021年iGEM榮獲金牌
照片圖說：生命科學系黃介辰特聘教授(前排左1)率隊參加2021年iGEM榮獲金牌
